Gen haritalaması, genlerin kromozomlar üzerinde bulunduğu
yerlerin (lokus) gösterilmesidir. Böylece insan genomunun
anatomisi ortaya çıkarılır. Pekçok genin ve diğer genetik
marker`larin birbirlerine göre bir kromozom boyunca diziliş
sırasının haritalanmasıyla bir kromozomun haritasını veya tüm
genom haritasını çıkarmak mümkündür. Bu haritalama, insan
vücudu fonksiyonlarının bilinmesi için gereklidir. Böylece
insan genetik hastalıklarının heterojenite ve segregasyon
analizleri bu bilgiler ışığında yapılabilecek ve gen tedavisi
gerçekleştirilebilecektir.
Sitogenetik
haritalama, genetik haritalama ve fiziksel haritalama olmak
üzere temelde üç tip gen haritası vardır.
Sitogenetik
haritalar, ilk olarak sitogenetik bantlama tekniklerinin
oluşturulmasıyla farklı kromozomları tanımanın yanında,
subkromozomal bölgelerin de ayırdedilmesiyle ortaya çıkmıştır.
Bu tür haritalar düşük rezolüsyonlu (yaklasık 6Mb) olmakla
birlikte genlerin ve diğer DNA dizilerinin haritalanmasında
çok basit bir yöntem olan kromozom in situ hibridizasyonu için
zemin hazırlamıştır. Böylece uygun koşullarda yapılan
hibridizasyondan sonra elde edilen sinyal probla, tanınan DNA
dizisinin bir harita lokasyonunun tanımlanması sağlanabilir.
Günümüzde in situ hibridizasyon teknikleri floresan in situ
hibridizasyon olarak geliştirilmiştir. Yöntem, belirli bir DNA
bölgesi kullanarak tüm kromozomlar içinde eşdeğer bölgeyi
bulmak şeklinde uygulanır. DNA bölgesi, radyoizotopla veya
floresanla işaretlendikten sonra ısıtma ve soğutma işlemlerini
takiben tek iplik haline getirilir. Boyanmamış ve lam üzerinde
yayılmış metafazlara uygulanır. Hazırlanan prob, metafazda yer
alan kromozomlardan kendi ile eşdeğer bölgesi ile birleşir
(1). Floresan kullanılarak geliştirilen yeni yöntemler, çok
kısa sürede klonlanmış DNA dizilerinin haritalamasında
kullanılmaktadır. Son yıllarda birden fazla farklı renkli
floresan işaretli problarla, kısa sürede daha fazla bölge
incelenebilmektedir. Ayrıca fenotipin, gözlemlenebilir
kromozomal yeniden düzenlenmeleri ya da kromozomal
eksikliklerle ilişkilendirilmesiyle de sitogenetik haritalar
oluşturulabilmiştir. Bunun yanında translokasyonlar ve
kromozomal delesyonlardan türemiş parçaları içeren somatik
hücre hibridleriyle doğal kromozom kırık noktaları ya da
radyasyon hibridleri kullanarak yapay kırık noktaları
haritalanabilir. Aynı zamanda düşük resolusyonlu fiziksel
haritalar olarak da adlandırılan bu sitogenetik haritalarda
çözünürlük, genellikle birkaç megabaz uzunluğundadır (2).
Somatik hücre
hibrid çalışmaları ile de, kromozomlar ve onlar üzerindeki
genlerin haritalaması çalışmaları yapılmıştır. En sıklıkla
fare ve insan olmak üzere iki farklı tür somatik hücreler,
birleştirici bir ajan veya özel inaktif viruslar aracılığı ile
birleştirilir. Farklı farklı fare insan hibrid hücre klonları
elde edilir. Başlangıçta bu klonlardaki hibrid hücrelerde hem
insan hem fare kromozomları bulunurken, insan kromozomlarının
bazıları her klonda farklı olmak üzere selektif olarak
kaybolur. Özel bantlama yöntemleri ile morfolojik olarak, fare
ve insan kromozomları kolayca ayırt edildiğinden hangi
kromozom kaybı ile hangi özelliğin etkilendiği belirlenmeye
çalışılmıştır. Örneğin bir enzim aktivitesi açısından fare
somatik hücresinde eksiklik varsa, ama hibrid hücrede bu
eksiklik gözlenmi-yorsa hangi insan kromozomu üzerinde bu
enzimin geninin bulunmakta olduğu belirlenmiştir. Somatik
hücre hibridizasyon yöntemi ile ilk gen haritalaması, timidin
kinaz enzim lokusunun 17 nolu kromozom üzerinde olduğunun
gösterilmesi ile gerçekleştirilmiştir (3).
Genetik
haritalama, kısaca genomun matematiksel analizi olarak bilinir
ve genlerin kromozomlar üzerindeki lokalizasyonlarının
bulunmasında moleküler biyolojik yöntemler ve bir dizi
karmaşık istatistiksel analizleri kullanır (4). Özellikle
genetik etyolojili hastalıkların lokalizasyonlarının
saptanması alanında son derece verimli bir metod olarak
karşımıza çıkmaktadır. Metod en genel anlamı ile lokalizasyonu
aranan gen ile lokalizasyonu bilinen bir genetik
belirleyicinin (“marker”) kuşaklar arasında birlikte
kalıtılması-nın test edilmesi esasına dayanır. Bilindiği gibi
kromozomlar mayozda karşı karşıya gelerek parça değişimine
uğrarlar (“crossing-over”). Bu parça değişimleri sırasın-da
birbirine yakın genler sıklıkla bir arada giderler. Uzak
yerleşimli genler ise bağımsız tertiplenme kura-lına göre
rastgele olarak bir arada gidebilirler ya da ayrılırlar.
Böylelikle yavru kuşaklarda ebeveynlerde olmayan yeni
yapılanmalar ortaya çıkar. Bu olaya “rekombinasyon” olayı,
ortaya çıkan ürünlere de “rekom-binant” ürünler denir (Şekil
1). Rekombinasyon kavra-mı genetik haritalama’nın kalbini
oluşturur. Temel hipotez “eğer aradığım gen kromozom
lokalizasyo-nunu bildiğim marker’a çok yakınsa mayozda
birbirlerinden ayrılamayacak ve kuşaklar arasında daima marker
allel ile birlikte kalıtılacaktır” şeklinde özetlenebilir.
Başka bir deyişle yavru kuşaklarda rekombinant bireylerin
fazla sayıda bulunması aradığımız genden uzaklaştığımız
anlamına gelecektir. Bu yolla marker allel’in yeri bilindiğine
göre (örneğin 2p13 bandı) ilgilendiğimiz genin ya da
hastalığın yeri de bulunmuş olacaktır.
Rekombinasyon
birimi centimorgan (cM) ile ifade edilir. 1cM her 100 kişide 1
rekombinant birey olduğunun göstergesidir (1/100=0.01) ve (theta)
işareti ile gösterilir. Genetik uzaklıklar fiziksel anlamda
ölçülebilir uzaklıklar değildir. Teorik olarak iki lokus
arasında 1cM’lık bir uzaklıktan söz edildiği zaman, yaklaşık 1
milyon baz çiftinden söz ediliyor demektir. Ancak bu her zaman
kesin değildir. Sık rekombinasyon yapan bölgelerde (rekombinasyon
hot spot’lari) 2-3 cM’lik bölgeler fiziksel anlamda bazen
beklendiğinden çok daha kısa olabilirler.
Bu metod yolu
ile bir gen haritalama çalışmasını yapabilmek için kuşaklar
arası kalıtımı izleyebileceğimiz ailelere ihtiyaç vardır. Yine
hipotezimizi oluşturmak için kalıtım kalıbının belirlenmesi
(tek gen, kompleks, mitokondrial vs.) ve marker kavramından
ne anladığımızın iyice açıklanması gerekmektedir. Genetik
haritalama işlemi, farklı moleküler biyolojik yöntemleri
teknik olarak kullanmakla birlikte temel olarak istatistiksel
bir analizdir ve tüm istatistik yöntemlerde olduğu gibi etkin
bir genetik haritalama yapabilmek için hipoteze yönelik
parametrelerin çok sağlam olarak belirlenmesi gerekir. Bu
metod kullanılarak herhangi bir nitelik (gen, marker, hastalık
gibi) haritalanmaktaysa da en geniş kullanım alanını, genetik
hastalıkların haritalanması oluşturmaktadır. Bu noktada
genetik etkenlere bağlı olduğunu düşündüğümüz bir hastalığın
gen haritalamasını yapmak istediğimizi varsayalım ve bu işlem
için gerekli aşamalar, nedenleri ve zorunlu parametreleri
üzerinde tartışalım.
1.
Haritalanacak fenotipin özellikleri iyi tanımlanmalıdır:
Fenotip: Bir varlığın genler ve çevre etkileşimleri sonucu
türlü metodlar ile ortaya konulabilen özelliklerinin tümü
olarak tanımlanabilir (5). Gen haritalamasının ilk aşaması
haritalanacak genin, hastalığın, ya da karakterin
özelliklerinin standartlar oluşturarak saptanmasıdır. Gen
harita-lama çalışmalarında genellikle çok sayıda aileden
toplanmış örneklere ihtiyaç vardır. Bu nedenle birden fazla
merkez örnek toplama işlemine katılır. Merkezler arasında
fenotip karmaşası yaşandığı durumda gen haritalama çalışması
yapmanın imkanı yoktur. Yine psikiyatrik hastalıklar gibi
hastalık spektrumunun kesinlikle belirlenemediği durum-larda
gen haritalama çalışmaları sıklıkla başarısız-lıkla
sonuçlanır.
2.
Haritalamada kullanılacak metoda karar verilmeli ve kalıtım
kalıbı olabildiğince kesin olarak belirlenmelidir. Kalıtım
kalıbının saptanmasının gen haritalama için seçilecek metodun
belirlenmesi ile çok yakın ilgisi vardır. Gen haritalama
metodları başlıca iki ana gruba ayrılır.
a)
Parametrik metodlar: Temel olarak Linkage (Bağlantı)
analizleri olarak bilinir (Ülkemizde kullanılan terim linkaj
analizidir ve metin içinde bu şekilde kullanılacaktır). Linkaj
analizinin başarılı olabilmesi için değişmez parametrelere
ihtiyaç vardır. Bunlar: 1- kalıtım kalıbı kesin olarak
bilinmelidir; 2- üç kuşaklı geniş aileler tercih nedenidir 3-
örnek toplama yaklaşımı kalıtım kalıbına göre olur. Örneğin
otozomal dominant bir gen ile kalıtılan bir hastalık
haritalanmak isteniyorsa örnek toparlama hasta bireyler, varsa
eşleri ve tüm çocukları yanısıra, normal bireylerin sadece
kendileri şeklinde olmalıdır. Otozomal resesif bir hastalık
söz konusu olduğu zaman ise, sıklıkla taşıyıcı olan anne-baba
ve tüm çocuklarının toplanması yeterlidir. Pedigri (aile
ağacı) analizleri yapılmaksızın sadece sporadik vakalar
üzerinden linkaj analizini uygulayabilmenin imkanı yoktur (6).
Şekil 2’de otozomal dominant bir genle kalıtılan bir hastalık
üzerinden linkaj analizi görülmektedir.
b)
Non-parametrik metodlar: Niteliklerin kalıtım kalıplarını
belirlemek her zaman kolay değildir. Pek çok genetik nitelik
çok faktörlü bir kalıtım kalıbı gösterir ve bunlar için
hipotez oluşturmakta zorluklar yaşanır. Yine her zaman birkaç
kuşağı bir arada bulmak ve örneklemek olanaksızdır. Özellikle
geç yaşta başlayan hastalıklarda genellikle önceki kuşaklar
ölmüştür, genç kuşaklarda ise henüz hastalık ortaya
çıkmamıştır. Bu durumda, eksiklikler göz önüne alınarak
parametrelerden bağımsız olan non-parametrik metodlar diğer
bir deyişle assosiyasyon çalışmaları önerilmektedir. Asso-siyasyon
çalışmaları için farklı istatistik analizler önerilmişse de
bunların hemen hepsinde kuşaklar arası segregasyonun test
edilmesinden çok, vaka ve kontroller arasında anlamlı fark
olup olmadığı test edilmektedir. Bu metodların linkaj
analizine göre avantajları: 1- Kalıtım kalıbının bilinmesine
gerek yoktur 2- Ailelerden çok vakaların ve kontrollerin
toplanmasına gerek vardır. Dezavantajları ise 1- Örnek sayısı
çok fazla olmalıdır 2- Özellikle kontrol grubunun
oluşturulmasında çok dikkatli olunmalıdır 3- Sadece bu metoda
dayalı gen bulunması maliyeti çok yüksek olan çalışmalardır ve
genellikle başarısızlıkla sonlan-mıştır. Şekil 3’te
assosiyasyon çalışmalarından anlamlı bir sonuç bulabilmek
için ideal olarak seçilmesi gerekli örnek sayıları
verilmiştir.
Görüldüğü
gibi her iki metodun da birbirine göre avantajları ve
dezavantajları vardır. Eğer lokalizasyonu tek başına
ispatlayacak büyüklükte aile paneli oluşturulabilmişse ve
nitelik tek gen kalıtım modellerinden birini gösteriyorsa
seçilecek metod tereddütsüz linkaj olmalıdır. Kompleks
niteliklerde assosiyasyon metodlarından birisi seçilebilir. Bu
amaçla günümüzde yaygın olarak önerilen iki aşamalı bir
çalışma planı izlenmektir (“two stage strategy”) (7). Burada
genellikle büyük aileler üzerinden tüm genom taranır.
Potansiyel lokus’lar saptandıktan sonra sadece ilgili
kromozom bölgelerine yönelik olarak assosiyasyon çalışmaları
düzenlenir.
3.
Haritalamada kullanılacak marker’lar (genetik belirleyiciler)
doğru olarak seçilmeli, mevcut gen haritaları etkin olarak
kullanılmalıdır. Bu kısımda gen haritalamasında kullanılan
“polimorfik marker” terimini tam olarak anlamak gereklidir.
Genetik yapıdaki değişiklikler en genel anlamı ile mutasyon
tanımı ile belirlenir. Mutasyonlar toplumda görülme
frekansları nadir olan (allel frekansı <0.0001) ve genetik
hastalıklardan sorumlu olan değişikliklerdir. Polimorfizm
kavramı da yine mutasyon gibi genetik materyaldeki bir
değişikliği gösterir ancak çoğu zaman mutasyonda olduğu gibi
fenotipik bir değişiklikle sonlanmaz. Polimorfik
değişikliklerde, nadir allel frekansı 0.01 dolayındadır yani
toplumda yaygın olarak gördüğümüz değişikliklerdir (8).
Örneğin genomda hastalıklardan sorumlu olmayan ancak kişiden
kişiye farklılık gösteren kısa DNA tekrarlarından oluşan
bölgeler vardır. Bunlar STRP (Short Tandem Repeat Polymorphism)
olarak adlandırılırlar. Burada ikili, üçlü ya da dörtlü
nükleotid tekrarları vardır. Bunlar içerdikleri kopya
sayılarına göre DNA örneklerinin farklı büyüklükte olmaları
ile sonlanır ve elektroforezde yürütüldükleri zaman farklı
büyüklükte bantların görülmesine neden olurlar (Şekil 1). Eğer
bir kişiye ait DNA örneği, genomda bu özelliği gösteren
bölgelere özgü primerler kullanılarak “Polimeraz zincir
reaksiyonu” (PCR, polymeraz chain reaction) yolu ile
çoğaltılır ve elektroforezde yürütülecek olursa o kişiye ait
polimorfik marker’lardan oluşan bir DNA profili ortaya çıkar.
Bu tıpkı parmak izi gibidir, bireyler arasında farklılık
gösterir. Birkaç kuşaklı aile bireylerinde böyle bir
amplifikasyon yapılırsa kromozomların kuşaklar arasında
dağılımı, bu polimorfik marker’lar aracılığı ile belirlenir.
Böylelikle baştan beri tartıştığımız kromozomlardaki mayozda
oluşan parça değişimleri ve sonundaki olası rekombinant
ürünler aile bireylerini birkaç kuşak izleme yolu ile
saptanabilir.
İnsan genom
projesinde genlerin haritalanması için ilk aşamada planlanan,
tüm genomda böyle polimorfik özellikler gösteren markerların
bulunması ve sadece bu bölgeleri çoğaltmaya yönelik primer
dizinlerinin kromozom lokalizasyonları ve birbirlerine göre
sıraları saptanarak bu bilgilerin kullanıma açılması idi. Bu
amaçla üç kuşaklı geniş aileler bulunarak örneklendi (CEPH;
Centre d’Etudes du Polymorphisme Humanie) (9). Bunlar genomda
bulunan polimorfik markerlar için tiplendirildi. Birbirlerine
göre olası lokalizas-yonları linkaj analizi yapılarak
hesaplandı ve haritalar oluşturulmaya başlandı. Eş zamanlı
olarak sitogenetik haritalama da bir kısım markerlar için
yapılarak sadece olasılık olarak lokalizasyonları değil
kromozom bantlarına göre de lokalizasyonları bulundu.
Sitogenetik olarak lokalizasyonları bilinen markerlar referans
noktaları olarak kullanılarak genomu 1-2 cM aralıklarla
tarayacak haritalar oluşturuldu. Genethon, Evry, Fransa
laboratuvarlarında son derece başarılı olarak saptanan bu
marker lokalizasyonları, araştırıcıların kullanımına açıldı
(9-11). Bunu takiben diğer gen haritalama üniteleri de kendi
bulgularını veri bankalarına koydular. Tablo I’de böyle bir
haritadaki birimlerin ne anlama geldiğini ve nasıl
kullanılacağı gösterilmiştir. Bu haritalara ait bilgilere, The
Center for Medical genetics, Marshfield (http://research.marshfieldclinic.org/genetics);
Cooperative Human Linkage Center (CHLC) (http://lpg.nci.nih.gov/CHLC);
UTAH Genome Center (http://www.genome.utah.edu); The Genome
Database (http://gdbwww.gdb.org) internet adresle-rinden ve
Genethon haritası için 6 numaralı kaynakçadan ulaşmak
mümkündür.
Bu haritalar
kullanılırken dikkat edilecek başlıca iki nokta vardır. 1-
Haritalar markerların kromozomlar üzerindeki sırasını ve
birbirlerine genetik olarak uzaklıklarını vermektedir.
Genotipleme yapılırken bu sıraların yanlış tutulması,
yerlerinin karıştırılması veya rekombinasyon biriminden (cM),
aralarındaki uzaklıklara dikkat edilmemesi gen haritalama
çalışmalarının başarısızlıkla sonlanmasına neden olur. 2-
Farklı merkezlerin marker haritaları birbirlerine göre
ayarlanmamıştır. Başka bir deyişle bir haritadan elde edilen
bilgiler ile yapılan bir haritalama çalışması diğer
haritalarla uygunluk göstermeyebilir. Bu nedenle genelde tüm
harita bilgilerine hakim olarak gerekli çalışmayı yapmak en
doğrusudur. Bu noktada tüm veri bankalarındaki verileri
karşılaştırmalı olarak bir oranda bünyesinde içeren The Center
for Medical Genetics, Marshfield, USA (http://research.marshfieldclinic.org/genetics)
veri bankasını referans olarak kullanmak yazarlardan birinin
(A.N.A; nakarsu@hacettepe.edu.tr) önerisi olacaktır.
Marker
haritalarındaki bilgileri kullanarak yapılacak bir gen
haritalaması için başlıca 2 yol seçilebilir:
a-
Aday lokalizasyon yaklaşımı: Burada haritala-nacak olan
niteliğe ait eldeki bütün veriler göz önüne alınarak aday
genler belirlenir. Örneğin baş-boyun bölgesine ait bir
malformasyon haritalanacaksa baş ve boyunda ifade bulan ve
gelişimsel olarak bu bölgelerin oluşumuna katkıda bulunan
genlerden başlamak daha olasıdır. Aday genler belirlendikten
sonra bu genlerin hangi kromozom bölgelerinde bulunduğu
saptanır ve bu bölgelere sıkı bağlantı gösteren marker’lar
öncelikli olarak test edilir. Bu tip marker bilgilerine
ulaşmak için OMIM (On-Line Mendelian Inheritance in Man) ve
LOCUSLINK internet adresleri en kullanışlı adreslerdir. Bu
adreslere National Resource for Molecular Biology Information
(NCBI) web sayfasından ulaşılabilir (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Bu veri bankaları birbirleri ile ilişkili olduğu için
düşünülen aday gen saptandığı anda, diğer veri bankalarına
ulaşılarak ilişkili marker bilgilerini almak olanaklıdır.
Aday bölgelerin taranması bitip de herhangi bir lokalizasyon
saptanamazsa tüm genomun taranmasına geçilir.
b-
Genom taraması (random genome-wide search): Burada hastalığın
hangi kromozomda ya da hangi aday gen ile ilişkili olacağına
dair bir öngörü yoktur. Genomu 10-20 cM aralıklarla tarayan,
kromozom lokalizasyonları belli marker panelleri kullanılarak
tüm genom rastgele taranmaya başlanır. İstatistiksel olarak
anlamlı sonuç bulunacak kromozom parçasına rastlanılmaya
çalışılır. Bazen tüm genom tarandıktan sonra bile lokus
saptanmayabilir. O zaman genomu daha sık aralıklarla tarayan
(5 cM) marker panellerine geçmek gerekli olabilir. Genomu 20cM
aralıkla taramak için gerekli olan marker sayısı yaklaşık 200;
8-10 cM aralıkla taramak için gerekli olan 400 ve 5cM aralıkla
taramak için gerekli olan sayı ise 750’den fazladır (10-11).
Bu sayıda marker ile çalışma maliyetinin, genotiplenecek örnek
sayısı arttıkça artacağı açıktır. O nedenle genom taramaları
için genellikle eldeki tüm örnekler kullanılmaz. İstatistiksel
olarak en çok bilgi verecek bireylerden oluşan bir başlangıç
paneli (initial screening panel) seçilir, genom bu bireyler
üzerinden taranır ve potansiyel lokus-ların ispatı ve bölgenin
daraltılması için eldeki tüm bireyler kullanılır (saturation
mapping)
Buraya kadar
anlatılanlardan anlaşılacağı gibi genetik haritalama için
kullanılan laboratuvar deneyleri teknik olarak karmaşık bir
yapı içermez. Kromozom lokalizasyonu bilinen primerler
kullanılarak PCR amplifikasyonu, poliakrilamid jel
elektroforezi, boyama ve genotipleme işlemleri yüzlerce kez
tekrarlanır. Bu nedenle floresan markerların kullanıldığı ve
tek bir çoğaltma işleminde çok sayıda marker kullanılan,
otomatik genotipleme yöntemleri geliştirilmiştir. Ancak bu
yöntemler zamandan tasarruf sağlarken maliyeti de çok
yükseltmektedirler.
Genetik
haritalama projelerinde kabul edilmesi gerekli bir diğer
önemli nokta da diğer araştırma disiplinlerinden farklı olarak
bu tip projelerin hazırlanmasında kesin sınırlarla belirlenen
kuralların olmayışıdır. Örnek sayısı, seçilecek metodoloji,
marker sayısı ve maliyet, niteliklerin kalıtım kalıplarına,
fenotipe, saptanabilen aile sayısına ve en önemlisi şans
faktörüne bağlı olarak değişebilir. Tamamen şans eseri olarak
taramaya başlanılan ilk lokalizasyonda bağlantının saptanması
ile genomu iki kez taradıktan sonra lokalizasyonu bulabilmenin
maliyetinin değişeceği açıktır. Kısaca denilebilir ki
yapılacak teknik işlem her çalışmada aynı olmasına karşın
yorum ve planlama her bir çalışmada farklı özellikler ve
tuzaklar içerir.
4.
İstatistik değerlendirmeler metoda göre seçilmelidir: Linkaj
analizi için; LOD Skor (Logaritm of Odds Ratio) analizi
uygulanır. LOD Skor: Linkaj saptanması olasılığının linkaj
gözlenmemesi olasılığına oranının logaritmik değerde ifade
biçimidir. Başka bir deyişle aranılan genin, test edilen
kromozom lokusunda olması olasılığının ilgili lokusta
bulunmaması olasılığına oranıdır. Sonuçta çıkan değer arttıkça
lokalizasyonun saptanması olasılığı da artacaktır. Örneğin bu
değer 5 gibi bir sayı çıkarsa aranılan genin test edilen
kromozom lokusundan seçilen marker’a bağlantı göstermesi
olasılığı bağlantı olmaması olasılığından 105 kez (100.000
kez) daha fazla olacaktır. Negatif değerler de lokustan
uzaklaşıldığının göstergesidir. LOD Skor = 3 ve üstü olan
değerler bağlantıyı desteklemesi açısından anlamlı kabul
edilirken 2 ve giderek negatifleşen değerler ise kesin olarak
bağlantı yokluğunu destekler. Aradaki değerler yoruma açıktır.
Lokusun ispatlanabilmesi için bir dizi farklı işlem yapılması
gerekebilir (aile ve örnek sayılarının arttırılması, genomun
diğer bölgelerinin araştırılması vs. gibi). Burada önemle
belirtilmesi gereken nokta bu analizde sonuçta bulunan bir
olasılık değeridir ve saptanan lokus hakiki lokus olmayabilir.
Nitelikten sorumlu ilgili gen ve gen içi mutasyon
gösterilinceye kadar lokus informas-yonu yanıltıcı olabilir.
LOD Skor
analizleri için yaygın olarak kullanılan program J. Ott
tarafından geliştirilmiş olan LINKAGE paket programıdır (12).
Bu program amaca göre kullanılacak 4 alt programdan oluşur (MLINK,
ILINK, LODSCORE ve LINKMAP programları). İki lokusun
birbirine göre test edilmesi (örneğin, hastalık lokusunun
marker allel’e bağlantısı) için en çok MLINK kullanılırken,
polimorfik nitelikteki markerların birbirlerine göre
lokalizasyonlarının ve sıralarının saptanmasında ILINK
programı kullanılmaktadır. LODSCORE tüm olasılıkların
hesaplanması yerine sadece maksimum olasılıkların
hesaplanmasında, LINKMAP ise birden fazla marker içinde
haritalanmak istenen genin göreceli pozisyonunun bulunmasında
(“multipoint linkaj analizi”) kullanılan alt programlardır.
Programın kullanımı sırasında özellikle parametrelerin
belirlendiği dosyaların oluşturulması özellik arz eder. Bu
amaçla farklı gen haritalama laboratuvarları LINKAGE programı
ile ilişkili ek programlar kullanmaktadırlar. Bu konuda
kullanılan tüm programlara http://linkage.rockefeller.edu/soft/list.html
adresinden ulaşmak mümkündür.
Assosiyasyon
metodları için; Bu alanda en sık kullanılan metodlar
şunlardır. 1- Vaka ve kontrol çalışmaları, 2- Identity By
Descent (IBD) (13) 3- Sib pair (14), 4- Affected Pedigree
Member (APM) (15), 5- Transmission Disequilibrium Test (TDT)
(16) ve 6- Haplotype Relative Risk (HRR) (17).
Fiziksel ya
da moleküler haritalar, genomik DNA`nın klonlanmış
parçalarının düzenlenmesiyle oluşturulurlar ve baz çifti
sayılarına göre ayarlanmışlardır. Genetik haritadan farkı
burada direkt olarak DNA’yı oluşturan bazların sırası
belirlenmiştir. Böylelikle genlerin fiziksel yapıları kesin
olarak ortaya konabilmektedir. Haritalama projelerinin en son
aşamadaki amacı olan fiziksel harita en yüksek rezolüsyona
sahiptir. Diğer yandan, ökaryotik genomun çok küçük bir
yüzdesi ifade olunduğu için, bazı fiziksel haritalama
yöntemleri, sadece trankripsiyonun gerçekleştiği dizilerin
tanımlanmasına yönelmiştir. Genetik haritada olduğu gibi insan
genomunun fiziksel haritası da 24 farklı kromozom için
oluşturulur. Farklı kromozomlar için bağlantılı polimorfik
marker gruplarını gösteren genetik haritaların tersine, farklı
tiplerde fiziksel haritalar oluşturmak mümkündür.
Fiziksel
haritalamanın en son hedefi DNA baz dizisinin çıkarılmasıdır.
Ancak geniş DNA bölgelerinin dizi analizinin yapılması teknik
açıdan güç olduğu için haritalamada çözünürlüğü 1 Mb`dan daha
aza indiren iki ana yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntemler
kullanılarak “Restriksiyon Haritalama” ve doğal olarak
uzatılmış ya da yapay olarak uzatılmış kromatin ya da DNA
fiberlerinde yüksek çözünürlüklü FISH’dir.
Rekombinant
gen teknolojisindeki son gelişmelerle birlikte genomik DNA
parçalarının klonlanması ve karakterizasyonuyla detaylı bir
gen haritası elde etmek mümkün hale gelmiştir. Sonuçta da
sadece gen yapısı hakkında bir kaynak olmakla kalmayan aynı
zamanda genomda dizi organizasyonu, gen ve genomların evrimi
hakkında da son derece değerli bir kaynak olan tüm bir
genomun DNA dizisinin elde edilmesi mümkündür. Günümüzde,
pekçok model organizmanın örneğin; bakteri, S.cerevisiae, C.elegans,
D.melanogaster, F.rubripes, D.rerio, insan gibi
organizmaların genetik ve fiziksel haritalarını çıkararak
sonuçta, tüm genom dizilerinin saptanmasını amaçlayan çok
yoğun bir şekilde devam eden bir uluslararası işbirliği
sürmektedir ve bu model organizmaların bazılarının tüm genom
dizi analizi tamamlanmıştır (Tablo II) (18). Genomların
haritalanması, analizi ve dizi analizi ile ilgili disipline
“genomiks„ adı verilmiştir.
Tüm dünyada
binlerce bilim adamının yaklaşık 15 yıl süren çabaları
sonucunda insan DNA`sının hemen hemen tamamlanmış nukleotid
dizisi yani haritası ortaya çıkmıştır. Gen haritaları
sayesinde bitki ve hayvan üreticileri genetik olarak
iyileştirilmiş kalitede üretim yapabilirken, insan genom
haritasının çıkarılması açısından bakıldığında, biyokimyasal
temeli bilinmeyen genetik hastalıklara neden olan genlerin
özgül bir kromozom ya da kromozom bantı üzerine haritalanması,
soyağaçları üzerinde bir marker ile olan bağlantısına
dayanarak bu genin izinin sürülmesi (gene tracking),
hastalığın tedavi edilmesi, insan ırklarının evrimleri ve
ırkların dünya üzerinde göç yollarının çıkarılması mümkün
olacaktır.
Nurten
AKARSU
Hacettepe Üniversitesi, Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları
Araştırma Merkezi, Gen Haritalama Laboratuvarı
e-mail:
nakarsu@hacettepe.edu.tr
Güven LÜLECİ
Akdeniz Üniversitesi Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı
e-mail:
luleci@med.akdeniz.edu.tr
